La cáscara del huevo: Un modelo de biomineralización

 

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Fernández, M. S., Arias, J.L.

Laboratorio de Biología Celular, Dpto. Ciencias Biológicas Animales Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias Universidad de Chile y Centro para la Investigación Interdisciplinaria Avanzada en Ciencias de Materiales

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CITA

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Fernández, M. S., Arias , J.L., La cáscara del huevo: Un modelo de biomineralización. Monografías de Medicina Veterinaria, Vol.20(2), diciembre 2000.

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Introducción

El proceso de mineralización biológica está ampliamente distribuido en la naturaleza. Puede encontrarse tanto en especies del reino monera, como protista, planta o ani­mal. Bajo condiciones fisiológicas, el resul­tado del depósito de mineral en los siste­mas biológicos está representado por la for­mación de huesos, dientes, cáscaras, ca­parazones, corales, perlas, etc. La gran di­versidad que puede alcanzarse por este pro­ceso queda demostrado, por ejemplo con las 128.000 especies de moluscos que se conocen, los cuales forman conchas de di­ferentes tipos, formas, tamaños y colores. El proceso de biomineralización es respon­sable también de algunos fenómenos pato­lógicos en vertebrados como la formación de cálculos renales o biliares.

 

La biomineralización puede ser definida como una secuencia de eventos en los cua­les los minerales secretados en solución por células particulares cristalizan y se estructuran juntos segun un plan de cons­trucción definida. Todos los elementos re­sultantes de este proceso tienen una carac­terística común, están compuestos por una fase inorgánica, frecuentemente sales de calcio, y una fase orgánica que puede estar compuesta por proteínas (fosfoproteínas, glicoproteínas), polisacáridos, lípidos y fre­cuentemente por una mezcla de ellos.

 

A pesar del gran número de estructuras mi­nerales diferentes que se han identificado en los organismos vivos, existen cuatro for­mas de minerales de calcio que son los más frecuentes de encontrar: aragonita, calcita, dahlita e hidroxiapatita.

 

En todo sistema biomineralizado se encuen­tran dos fases: una matriz orgánica y una fase mineral cristalina, razón por la cual los siste­mas biomineralizados son considerados como biocerámicas (Heuer et al., 1992). Estas biocerámicas se forman generalmen­te en un medio acuoso, a relativamente bajas temperaturas y en todos los casos anali­zados su formación es regulada por una ma­triz orgánica. La velocidad de depósito de la parte inorgánica de estas biocerámicas va­ría desde unos pocos gramos al año, como ocurre en la formación del nácar de la con­cha de los moluscos, hasta el extremo de cin­co gramos de calcio por día como ocurre en la cáscara de huevo. Esto hace de la cásca­ra de huevo un modelo muy conveniente para el estudio del apasionante tema de la biomineralización (Arias et al., 1993).

 

Organización estructural y composición de las cáscaras del huevo

 

 

La cáscara del huevo es una biocerámica com­puesta de una fase orgánica y otra inorgánica. Químicamente está compuesta de 1,6% de agua, 95,1 % de minerales, de los cuales 93,6% corresponden a carbonato de calcio en forma de calcita, 0,8% de carbonato de magnesio y 0,73% de fosfato tricálcico, y finalmente 3,3% de materia orgánica. En ella ocurre nucleación heterogénea primaria y secundaria a partir de las mamilas (Arias et al., 1991 d). Estructuralmente la cáscara de huevo de aves está constituida por cuatro capas, a saber: a) membrana de la cáscara, b) capa mamilar, c) capa en empalizada y d) cutícu­la (Fig. 1). El remanente orgánico después de la desmineralización de la capa en em­palizada constituye la matriz de la cáscara. Estos componentes se depositan sucesiva­mente a manera de una línea de ensambla­je a medida que el huevo avanza a lo largo del oviducto.

 

Fig. 1. Esquema de la estructua de la cáscara del huevo. m: menbranas de las cáscara; ma: mamillas; p: capa en empalizada; c: cutícula.

 

Fig. 1. Esquema de la estructua de la cáscara del huevo. m: menbranas de las cáscara; ma: mamillas; p: capa en empalizada; c: cutícula.

 

A. Capa de las membranas de la cáscara

 

Las membranas de la cáscara corresponde a la capa más interna de la cáscara del hue­vo y están formadas por un entramado fibrilar. Las fibras que las componen pesan en conjunto 145 mg, tienen un diámetro de alrededor de 70 nm (Simkiss y Taylor, 1971) y consisten en un núcleo central cubierto por un material amorfo llamado manto de dife­rente composición química (Masshoff y Stolpmann, 1961).

 

Las membranas de la cáscara se encuen­tran dispuestas en dos capas, una interna de 20 µm de grosor que está en contacto con la albúmina y otra externa de 50 µm de gro­sor que está situada entre la zona mineralizada de la cáscara y la membrana interna. Estas dos membranas están en ínti­mo contacto en toda su extensión, excepto a nivel de la cámara de aire donde se encuen­tran separadas (Simkiss, 1968; Wilburn y Simkiss, 1968; Parson, 1982).

 

Cada membrana está formada por una red de fibras orgánicas dispuestas sobre la albú­mina en una disposición paralela a la super­ficie de la cáscara. En un corte transversal cada fibra está compuesta por un centro pro­teico rodeado por un manto de mucopolisacáridos. El manto está separado del centro o núcleo por un espacio de 0,1 µm de espesor, en este espacio se encontrarían los escasos lípidos de la membrana de la cáscara (Candlich, 1972). Los centros de las fibras de la membrana son de 23 µm de lon­gitud y sus extremos se superponen con los extremos de sus vecinas, compartiendo un manto común de 6 µm El diámetro de las fibras internas es de un promedio de 0,9 µ m con un máximo de 1,5 µm . En la membrana externa la longitud de las fibras es de 15 pm con un diámetro de 1-3 µm (Simons y Wiertz, 1963; Simons, 1971).

 

La parte orgánica de las membranas de la cáscara está constituida por 3% de lípidos, 2% de azúcares y 95% de proteínas. La naturaleza de las proteínas ha sido motivo de muchas controversias. Los primeros es­tudios sugirieron la presencia de queratina (ovoqueratina) (Simons y Wiertz, 1963; Krampitz y Engels, 1975), lo que fue cues­tionado por evidencias basadas en la pro­piedad de solubilidad y estructura (Vadhera et al., 1971). Actualmente se acepta que la queratina no es un componente de las mem­branas (Arias et al., 1991 a ).

 

Por otra parte, la presencia de colágeno fue sugerida por el aislamiento de hidroxilisina de las membranas de la cáscara (Candlish y Scougáll, 1969). Posteriormente se inmunodetectó la presencia de colágeno tipo I, predominantemente en las fibras gruesas de las membranas de la cáscara externa y colágeno tipo V predominantemente en las fibras finas de la membrana interna (Wong, 1984). Usando tinción de orceína, Simons (1971) concluyó que la proteína elastina estaba presente en el manto de las fibras pero no en el núcleo. Se han detectado hidroxiprolina, desmosina e isodesmosina, pero la secuencia de aminoácidos es dife­rente a la elastina de mamíferos y resisten­te a la elastasa (Crombie et al., 1981; Starcher y King, 1980; Leach et al., 1981). Más recientemente se ha detectado colágeno tipo X como principal constituyen­te de las fibras de las membranas (Arias et al., 1991 a ,b).

 

La superficie interna de la membrana interna es lisa debido a la presencia de una capa delgada y homogénea de 2,7µm de grosor (Simons y Wiertz, 1963), que impide el paso de la albúmina hacia los espacios entre las fibras. Bellairs y Boyde (1969) llaman a esta capa, membrana limitante. Estudios al micros­cópico electrónico sugieren que está com­puesta del mismo material que el manto de las fibras y se continúa con él (Simons y Wiertz, 1963; Bellairs y Boyde, 1969). Adicionalmente se ha detectado inmunocitoquímicamente laminina en esta estructura (Dieckert, 1992).

 

B. Capa mamilar

 

La capa mamilar corresponde a menos de 1/3 del grosor de la cáscara (100 µm ). Está constituida por las mamilas a partir de las cuales se inicia la mineralización. En estos sitios se desarrollan los conos, base de las columnas cristalinas, que a medida que cre­cen se fusionan con sus vecinos.

 

Las mamilas son pequeñas masas de ma­terial orgánico distribuidas de manera dis­creta, unidas a la superficie externa de la membrana externa. Representan los sitios de unión del depósito de cristales, los que posteriormente quedan incluidos en la capa de los conos.

 

Por estudios histoquímicos Simkiss y Tyler (1957) sugirieron que las mamilas consisten en un complejo proteína-mucopolisacáridos ácidos. Robinson y King (1968) encontraron que las mamilas contenían mucopo­lisacáridos neutros rodeados por una sustan­cia débilmente ácida que podrían ser sialomucinas. Más recientemente se ha de­mostrado inmunocitoquímicamente la pre­sencia de queratán sulfato en las mamilas del huevo de gallina, codorniz, faisán y pavo, mientras que condroitin-6-sulfato se demues­tra en las mamilas del huevo de gallineta (pin­tada) y pato (Arias et al., 1992; Pan heleux et al., 1999). Este queratán sulfato forma parte de un proteoglicano llamado mamilán, cuyo núcleo proteico aún no se encuentra carac­terizado del todo (Fernández et al., 2000).

 

Es a partir de estas mamilas que se inicia la mineralización por el depósito de cristales de calcita. El crecimiento de estos cristales hacia el interior del huevo está limitado por las membranas de la cáscara (Arias et al., 1991 a ).

 

Dieckert et al (1989) distinguen dentro de la mamila una zona basa¡, en contacto con las membranas de la cáscara, llamada región de reserva de calcio (CRA: calcium reserve assembly) y por sobre esta región la coro­na. La CRA representa la fuente de calcio primaria del embrión. Dentro del CRA se distingue una placa basal (BS: basal plate), que es la porción en íntimo contacto con la membrana de la cáscara externa, y un cuer­po de reserva de calcio (CRB: calcium re­serve body). La CRA es la zona de la mami­la que sufre la descalcificación a partir de la segunda mitad del desarrollo del embrión, lo que demuestra su calidad de reservorio de calcio (Dieckert et al., 1993).

 

La estructura y la conformación de la capa mamilar son los factores determinantes de la solidez de la cáscara. Existe, en efecto, una correlación entre la densidad de las mamilas (n° de mamilas por cm2) y la solidez de la cáscara (Fujii, 1974; Parson, 1982).

 

C. Capa en empalizada

 

Esta capa corresponde a la capa más grue­sa de la cáscara de huevo (200-350 µm ) y está compuesta por componentes orgáni­cos e inorgánicos en forma integrada. El componente inorgánico corresponde a car­bonato de calcio en forma de calcita y el componente orgánico (matriz de la cásca­ra) que corresponde al 2-5% (peso seco) es en un 2% proteico.

 

Estudios morfológicos y cristal ográficos re­velan tres subzonas (Terepka, 1963; Perrot et al., 1981; Sharp y Silyn Roberts, 1984): Zona de los conos: Es la zona más interna y está formada por cristales que no presen­tan una orientación preferencia¡. Los crista­les de esta zona son los primeros en depo­sitarse durante la formación de la cáscara. Zona central: En esta zona, los cristales adoptan una orientación más preferencia¡. Entre los cristales se encuentran abundan­tes vesículas.

 

Zona externa o de cristales verticales. Esta zona tiene un grosor de 3-8 µm y en ella se encuentra una orientación vertical de los cristales. Se ha sugerido que en esta zona el depósito de calcio se haría en ausencia de matriz (Fujii, 1974; Arias et al., 1991 d). Sin embargo recientemente se ha descrito que en esta zona la matriz orgánica cambia de la disposición paralela rica en vesículas de 450 nm de diámetro de la capa central a una matriz orientada perpendicular a la su­perficie de la cáscara, esta matriz se hace más estrechamente empaquetada en la interfase entre la capa de los cristales verti­cales y la cutícula (Dennis et al., 1996, Fraser et al., 1998).

 

La cáscara posee poros que permiten el intercambio gaseoso, y que resultan de la falta de sellamiento entre columnas crista­linas vecinas. Los poros atraviesan verti­calmente esta capa. Tienen forma de em­budo con su base amplia dirigida hacia la superficie y presentan un diámetro, en el extremo que enfrenta las membranas de la cáscara, de 6 µm y de 65 µmen el extre­mo que enfrenta la cutícula. Se estima que el número de estos varía entre 100-300 por cm2 de cáscara.

 

La materia orgánica representa sólo el 3% de los componentes de I capa en empaliza­da. Su composición está dado por un 70% de proteínas, 11% de polisacáridos y algo de lípidos (Simkiss y Tyler, 1957). El análi­sis aminoacídico sugiere la presencia de una proteína no colagenosa parecida a la que se asocia a condroitín sulfato en cartílago (Backer y Balch, 1962). Muchos componen­ tes de la matriz son característicos de los sistemas que unen calcio. Se sabe que la matriz de la cáscara de huevo es capaz de quelar iones gracias a su contenido en mucopolisacáridos y que estos se encuen­tran en la mayoría de los sitios donde ocu­rre calcificación (Simkiss y Tyler, 1958). Se ha encontrado un polipéptido, llamado ovocalcina, que une calcio desde la matriz de la cáscara de huevo (Krampitz et al., 1980). Sin embargo, éste no ha sido carac­terizado. Posteriormente Hincke et al. (1992) por medio de técnicas electroforéticas, han puesto en evidencia otras proteínas cuyo peso molecular varía entre 14 y 200 kDa, de las cuales una ha sido aislada (Hincke et al., 1995) correspondiendo a la proteína de 17 kDa u ovocleidina. Esta proteína está compuesta mayoritariamente por tres aminoácidos: glicina, arginina y alanina (Mann, 1999; Mann y Siedler, 1999). Con­juntamente con estos componentes se han descrito otras proteínas como la osteopontina, que es característica del hue­so (Pnes et al., 1994; Lavelin et al., 1998), junto a ovoalbúmina, ovotransferina y lisozima, que parecen provenir de la clara (Hincke, 1995; Gautron et al., 1997) pero cuya función en la mineralización de la cás­cara es discutible.

 

Con respecto a los polisacáridos de la ma­triz orgánica de la cáscara estos están constituidos preferentemente por glucosamina, galactosamina, manosa, fucosa lo que habría sugerido la presencia de condroitín sulfato (Backer y Balch, 1962). Sin embargo se ha detectado me­diante anticuerpos monoclonales sólo la presencia de dermatán sulfato en la matriz de la cáscara de huevo, no encontrándose evidencias de condroitín-4-sulfato ni condroitín-6-sulfato en la cáscara de hue­vo de gallina (Arias et al., 1992, Carrino et al., 1996, 1997). Sin embargo, condroitin­6-sulfato es el componente principal de la matriz de la cáscara del huevo de la codor­niz (Panheleux et al., 1999). El dermatán sulfato de la matriz de la cáscara forma parte de un proteoglicano llamado ovoglican (Fernández et al., 2000), que po­see un núcleo proteico de 116 kDa (Carrino . et al., 1996, 1997; Hincke et al., 1999) y cadenas del glicosaminoglicano de 22 kDa.

 

D. Cutícula

 

La cutícula es la capa más externa del hue­vo. Está compuesta de glicoproteínas y en ella se encuentran los pigmentos respon­sables de la coloración de la cáscara. Su grosor es de 10 µm en promedio y cubre los poros preservando el interior del huevo de la contaminación microbiana. La región más interna de la cutícula tiene agregados esféricos de cristales en forma de aguja que corresponden a hidroxiapatita (Dennis et al., 1996; Fraser et al., 1999). Los pigmentos de las cáscaras coloreadas (porfirinas) se encuentran en su gran ma­yoría en la cutícula y en algunas especies alcanzan la zona superficial de la capa calcificada. Al microscopio electrónico de barrido la cutícula muestra fisuras, con as­pecto de barro seco, producto de la deshi­dratación y la oxidación de los grupos SH de las proteínas presentes en ella.

 

Según Wedral et al. (1974) su composi­ción es de un 85-87% de proteínas, 3,5­4,4% de carbohidratos y 2,5-3,5% de lípidos. La mayor parte de las proteínas que la componen son insolubles en el agua y cloruro de potasio. Como aminoácidos mayoritarios se encuentran ácido glutámico, ácido aspártico, glicina y arginina. Como parte de su composición glucocídica se encuentran: galactosa, manosa, glucosa, fucosa, ácido siálico y galactosamina (Baker y Balch, 1962). La ausencia de ácido urónico sugiere que no habría mucopolisacáridos ácidos. Sin em­bargo, queratan sulfato un proteoglicano de queratán sulfato, aunque no necesa­riamente idéntico al descrito en las mamilas, se ha encontrado en la cutícula (Arias y Fernández, 1995).

 

La cutícula tiene una estructura vesicular (Simons, 1971) y sirve como defensa a la invasión bacteriana sin embargo su princi­pal rol parece ser proteger al huevo de la perdida excesiva de agua por un mecanis­mo que depende de la humedad ambiental (Peebles y Brake, 1986; Peebles et al., 1987). Por otra parte es la responsable de terminar el depósito de calcio en la capa en empalizada (Nys et al., 1999). Se depo­sita sobre todo el huevo inmediatamente antes de la ovipostura (Board y Fuller, 1994).

 

[ Formación de la cáscara de huevo ]

 

 

Los constituyentes del huevo se elaboran en dos fases sucesivas. En el ovario se de­posita el vitelo durante los 10 a 12 días que preceden a la ovulación. Una vez ovulado y durante su paso por el oviducto, se deposi­tan los otros constituyentes del huevo. Esta fase dura 24 a 26 horas.

 

Morfológica y funcionalmente el oviducto puede dividirse en seis regiones: Infundibulum, Magnum, Istmo, Istmo rojo o Glándula Tubular de la Cáscara , Glándula de la Cáscara propiamente tal y Vagina. Un corte transversal de cualquiera de estas re­giones muestra siete capas que pueden ser agrupadas en un tejido secretor, uno mus­cular y uno conectivo (Sauvers y Reviers, 1992). Todos los segmentos excepto la va­gina, están involucrados en el proceso de formación del huevo.

 

El Infundibulum corresponde a la región más proximal al ovario, y es el sitio donde ocurre la fecundación antes del depósito de la al­búmina. En este segmento la yema pasa sólo algunos minutos (15-20 min). La región cefálica del Infundibulum es simple, sus plie­gues de la mucosa son bajos y están tapi­zados por células ciliadas no secretoras. A medida que el Infundibulum se estrecha, los pliegues de la mucosa se hacen más pro­nunciados dando origen a pliegues secun­darios y terciarios. El epitelio que tapiza la región media y caudal del Infundibulum es seudoestratif¡cado y contiene células ciliadas y células secretoras no ciliadas. Las glándulas tubulares aparecen sólo en la unión del Infundibulum con el Magnum. A medida que se avanza caudalmente las crip­tas dan origen a verdaderas glándulas (Solomon, 1983).

 

En el Magnum el huevo permanece 3-4 ho­ras. Aquí se sintetiza la totalidad de las pro­teínas de la albúmina o clara. En esta re­gión los pliegues de la mucosa son promi­nentes y están tapizados por células ciliadas y no ciliadas, las que se hacen más altas caudalmente. Durante el tránsito del huevo estos pliegues son comprimidos y aplasta­dos lateralmente (Solomon, 1983). El Magnum está separado del Istmo por una zona delgada aglandular tapizada por células ciliadas y no ciliadas (Solomon,1983).

 

Wybum et al.,(1970) describen tres tipos de células en las glándulas tubulares: A, B y C. La liberación de la albúmina es probable­mente afectada por la estimulación mecáni­ca del huevo en descenso. Las células res­ponsables de la elaboración de las proteí­nas de la albúmina no han sido identifica­das inequívocamente, pero Kohler et al. (1968), Oka y Schimke (1969) y Wiburn et al. (1970), proponen que las células tipo A de las glándulas serían la fuente de ovoalbúmina mientras que las tipo B serían las productoras de lisozima bactericida. Se supone que la ovomucina y la avidina se­rían secretadas por la célula epiteliales que tapizan la superficie del Magnum (Kohler et al., 1968; Wiburn et al., 1970).

 

En el Istmo el huevo permanece 1-2 horas, aquí ocurre el depósito de las membranas de la cáscara. El Istmo es más angosto que el Magnum y sus pliegues menos volumi­nosos, su límite superior está claramente determinado por la zona aglandular pero su límite inferior es controversial. Está tapiza­do por un epitelio seudoestratificado columnar con células ciliadas y no ciliadas.

 

Las glándulas tubulares del Istmo son se­mejantes en apariencia a las del Magnum, pero sus secreciones tienden a formar lar­gos filamentos a diferencia de la masas amorfas características de la secreción del Magnum. Son estas glándulas las respon­sables de la producción de colágeno tipo X principal componente de las membranas de la cáscara, esta secreción se inicia a las 3:30 h post ovipostura, alcanza su máxima pro­ducción a las 5:00 h post ovipostura coinci­dente con la presencia del huevo en esta región y luego disminuye hasta desapare­cer a las 6:00 h post ovipostura (Fernández et al., 1997; Fernández et al., 2000).

 

Las fibras de colágeno adquieren paulati­namente una superficie uniforme lo que su­giere un proceso secuencia¡ de fibrilogénesis. El hecho que el colágeno tipo X se ubique exclusivamente en estructuras que nunca se mineralizan, como son las membranas de la cáscara y alrededor de condrocitos precediendo la osificación endocondral, ha hecho que se sugiera que esta molécula tendría un efecto inhibitorio de la mineralización (Arias et al., 1997a). Sin embargo se desconoce aún el papel exacto que el colágeno tipo X jugaría en la mineralización. Aunque las membranas de la cáscara del huevo no participen directa­mente en el proceso de mineralización de la cáscara, su presencia es indispensable para la formación de la cáscara (Krampitz y Witt, 1979). La perturbación de su forma­ción reduce la mineralización de la cáscara (Leach et al., 1981; Klingensmith et al., 1988; Chowdhury, 1990; Arias et al., 1997b).

 

En el Istmo rojo o Glándula Tubular de la Cáscara ocurre el depósito de las mamilas lugar donde se iniciará la mineralización de la cáscara. El Istmo rojo se encuentra tapi­zado por un epitelio columnar compuesto por células ciliadas y células no ciliadas con microvellosidades. Bajo este epitelio se en­cuentran las glándulas tubulares las cuales inician la producción de queratán sulfato, presente en las mamilas, a las 5:00 h post ovipostura alcanzando su máxima produc­ción a las 5:15 h post ovipostura coincidien­do con la presencia del huevo en esta re­gión (Fernández et al.,1997; Fernández et al.,2000).

 

Sobre estas estructuras es donde ocurre la nucleación de los primeros cristales de car­bonato de calcio, lo cual constituye el ori­gen de las columnas cristalinas que forman la capa en empalizada (Arias y Fernández, 1993). Las mamilas fueron descritas como centros de nucleación de los cristales de calcita (Parson, 1982). Esto implica que las mamilas tienen una disposición de los gru­pos químicos cargados tal que proveen un molde sobre el cual los iones calcio y car­bonato se fijan originando la trama de cris­tales de calcita.

 

Así el ácido siálico descrito en la superficie de las mamilas (Cooke y Balch, 1970), que fácilmente se acompleja con los iones cal­cio (Lura, 1963) así como el queratán sulfato polianiónico (Arias et al., 1992) podrían es­tar involucrados en la nucleación. Una vez que la cristalización se inicia, los diversos componentes orgánicos de la matriz que unen calcio podrían modular la formación de las columnas de calcita. Estos compo­nentes de matriz, complementarían su ac­ción con la de la anhidrasa carbónica que localiza una alta concentración de iones carbonato, derivados ya sea de bicarbona­to o de dióxido de carbono metabólico (Krampitz y Witt, 1979).

 

La presencia de queratán sulfato (mamilán) desde el comienzo de la formación de es­tas mamilas, dada sus características físi­co-químicas en relación a su afinidad por calcio, hace de esta molécula un buen can­didato como regulador de la nucleación de los primeros cristales de calcita.

 

Al abandonar el Istmo rojo el huevo alcanza la Glándula de la Cáscara donde permane­cerá aproximadamente 20 horas. En esta región ocurren dos fenómenos: hidratación de las proteínas de la clara lo que hace que el huevo tome estrecho contacto con la pa­red de esta región y mineralización de la cáscara que se produce por la precipitación de calcio en asociación con una trama or­gánica. Esta precipitación tiene lugar en un medio acelular hipersaturado de calcio y carbonato: el fluído uterino. Durante las pri­meras horas este depósito es muy lento, luego se hace intenso hasta llegar a 330 mg/ h entre las 10 y 22 horas después de la ovu­lación.

 

La mucosa de la Glándula de la Cáscara está compuesta por un epitelio que recubre los pliegues en forma de hoja que la forman y por las glándulas tubulares contenidas en estos pliegues.

 

Al igual que en el Istmo rojo el epitelio de la Glándula de la Cáscara está formado por cé­lulas ciliadas y no ciliadas con microve­Ilosidades (Solomon, 1983). Las células epiteliales no ciliadas son las responsables de la producción de dermatan sulfato (ovoglicán), importante molécula de la matriz orgánica de la cáscara. Su producción por las células epiteliales de esta región se inicia a las 5:00 h post ovipostura, alcanza su máxima produc­ción a las 6:00 h post ovipostura, para luego disminuir hasta desaparecer a las 18:00 h post ovipostura (Fernández et al., 1997; Fernández et al., 2000).

 

La producción de dermatán sulfato (ovoglicán) por las células epiteliales de la glándula de la cáscara es coincidente con la etapa de crecimiento de los cristales de calcita. El hecho que esta molécula sea el principal componente de la matriz de la cás­cara hace que sea esperable que ésta esté asociado al crecimiento de las columnas de calcio que forman la capa en empalizada. De hecho, ovoglicán es capaz de modificar la morfología de los cristales de calcita in vitro (Wu et al., 1992, 1994), cuestión que parece depender de su grado de sulfatación (Fernández et al., 2000).

 

La aparición paulatina de textura cristalográfica concomitante con el depósi­to de dermatán sulfato (ovoglicán), sugiere que esta molécula podría favorecer el cre­cimiento de algunas caras cristalinas, posi­blemente por inhibir el crecimiento de otras. Durante las dos últimas horas de formación de la cáscara, se detiene la mineralización y se inicia el depósito de cutícula. Luego del depósito de ésta, la Glándula de la Cáscara se contrae y expulsa el huevo hacia la vagi­na (Solomon, 1983)(Fig. 2).

Fig. 2. Esquema que resume las etapas de for­mación de la cáscara del huevo. En la primera columna de la izquierda se señalan las regiones del oviducto y en la fila superior, las horas en las que ocurren tanto la secreción de las macromoléculas implicadas en la mineralízación de la cáscara como el desarrollo de las estructu­ras que la componen. E. epitelio de revestimien­to; G: glándulas tubulares; DS: dermatán sulfato (ovoglicán); KS: queratán sulfato (mamilán); Col: colágeno tipo X.

 

Fig. 2. Esquema que resume las etapas de for­mación de la cáscara del huevo. En la primera columna de la izquierda se señalan las regiones del oviducto y en la fila superior, las horas en las que ocurren tanto la secreción de las macromoléculas implicadas en la mineralízación de la cáscara como el desarrollo de las estructu­ras que la componen. E. epitelio de revestimien­to; G: glándulas tubulares; DS: dermatán sulfato (ovoglicán); KS: queratán sulfato (mamilán); Col: colágeno tipo X.

 

[ Calcificación de la cáscara ]

 

 

El calcio que se deposita sobre la cáscara se obtiene de la sangre, no existe un alma­cenamiento de calcio en la glándula de la cáscara antes de la calcificación (Hodges, 1969). La formación de la cáscara implica la exportación de 2 g de calcio lo que co­rresponde a 8 a 10% del contenido corporal de calcio. El 98% de calcio se encuentra en los huesos pero la participación de estos últimos está limitado por el aporte directo de calcio alimentario absorvido a nivel intestinal. El depósito de calcio en la cáscara (150 mg/h) obliga a la renovación total del calcio sanguíneo cada 12 h por día (Nys, 1990; Sauvers y Reviers, 1992).

 

La principal fuente de calcio la constituye la dieta, el intestino participa directa y activa­mente en la regulación del metabolismo cálcico, dado que la retención intestinal de calcio pasa durante la formación de la cás­cara del 40 al 80%. Sin embargo no todo el calcio que se deposita en la cáscara proce­de del intestino, una parte tiene su origen en el esqueleto.

 

En condiciones normales de aporte alimentario de calcio, la movilización del calcio óseo es importante al final de la noche cuando el tracto digestivo ya no contie­ne suficiente calcio absorvible. Esta movili­zación de calcio óseo es facilitada por la presencia de hueso medular localizado en la cavidad medular de algunos huesos (Nys, 1990; Sauvers y Reviers, 1992).

 

La calcificación de la cáscara se produce en la glándula de la cáscara (útero) mientras el huevo se encuentra bañado en el fluído ute­rino. En este fluído uterino, el calcio y los bicarbonatos se encuentran en concentracio­nes tan elevadas que el producto de solubilidad de la calcita es superado cien veces. Se considera entonces que este me­dio se encuentra hipersaturado, de modo que en estas condiciones es posible la precipita­ción espontánea de calcio (Nys et al., 1991). La concentración de calcio y carbonatos no es el factor determinante de la detención de la mineralización; en el momento que esta se detiene, dos horas antes de la ovipostura, el grado de hipersaturación del fluído es aún sesenta veces superior al producto de solubilidad del carbonato de calcio (Nys et al., 1991).

 

La detención de la mineralización podría de­berse a la inhibición de la mineralización por efecto de la secreción de un inhibidor de ésta. La presencia de fósforo, inhibidor de la for­mación de calcita (Bachra, 1963) en las ca­pas superficiales de la cáscara y la modifica­ción de la morfología de los cristales en la capa superficial (Quintana y Sandoz, 1978), refuerza esta hipótesis. La inhibición podría deberse a un compuesto orgánico fosforilado, el hecho que en la cutícula se encuentre hidroxiapatita (fosfato de calcio) es una evi­dencia del rol competidor del fosfato sobre el carbonato por el ion calcio (Dennis et al., 1995). Por otra parte el hecho que cese el depósito de calcio a pesar de mantenerse un medio hipersaturado apoya esta hipóte­sis (Nys et al., 1991).

 

[ Conclusiones ]

 

 

El ensamblaje de la cáscara de huevo y el proceso de mineralización que ocurre en su formación es guiado por una colección de biomoléculas que son depositadas secuencialmente a medida que el huevo se desplaza a lo largo del oviducto. La natura­leza de estas macromoléculas parece de­terminar la estructura particular, la orienta­ción y la labilidad de remoción de los crista­les de calcita.

 

Esto significa que subyacente al proceso de formación de la cáscara existe un exquisito control temporal y espacial que determina el momento y forma de nucleación y creci­miento de la fase cristalina, cuyos detalles precisos continúan siendo desconocidos.

 

Agradecimientos

 

Este trabajo ha sido parcialmente financia­do con el Proyecto FONDAP 11980002.

 

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